Лабораторные результаты: полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Лабораторные результаты: полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Он состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), которая составляет генетический код человека, а также животных и растений.

В медицине человека ПЦР используется для выяснения наследственных заболеваний и генетических проблем (риск заболевания, тест на отцовство и т. Д.), А также для диагностики многих инфекционных заболеваний. В отличие от серологической диагностики (определение антител к возбудителям в крови), методы ПЦР представляют собой прямой лабораторный медицинский метод обнаружения для выявления инфекционных заболеваний.

С одной стороны, преимуществом ПЦР является быстрая доступность результатов тестирования. Кроме того, методы ПЦР обычно очень чувствительны.

навигация

• продолжить чтение
• больше по теме
• Советы, загрузки и инструменты
• Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР) и что она исследуется?
• Как работает ПЦР?
• Какие результаты дает ПЦР?
• Есть ли дальнейшие разработки в области традиционной ПЦР?
• Каковы основные области применения ПЦР?
• Существуют ли контрольные значения для результатов ПЦР-теста?

Это означает, что даже самые маленькие количества генетического материала патогена (бактерии, вирусы и т. Д.) Приводят к достоверно положительному результату в течение периода обнаружения соответствующего патогена в соответствующем тестовом материале. В первую очередь кровь, но также и другие биологические жидкости (мокрота, моча, ликвор и т. Д.) Используются в качестве материалов исследования для методов ПЦР.

Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР) и что она исследуется?

Полимеразная цепная реакция («Полимеразная цепная реакция» - ПЦР) - важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. По этой причине эту процедуру расследования также называют так называемым

«Молекулярная диагностика»

Основа генетического материала (также называемого «генетическим материалом») - это особая длинноцепочечная молекула:

«ДНК» (дезоксирибонуклеиновая кислота)

У человека генетический материал, состоящий из двухцепочечной ДНК (двух комплементарных цепей), расположен в ядре всех клеток организма, при этом все клетки организма человека имеют идентичный генетический материал. Кроме того, точный состав генетического строения каждого человека уникален - сравним с отпечатком пальца, который также уникален для каждого человека.

По этой причине генетический материал также называют

«Генетический код» означает, что план всех структур тела человека нанесен на карту в этой зашифрованной форме, сохранен таким образом и может быть передан

В ядрах клеток тела ДНК находится в особом порядке, известном как

Называется «Хромосомы» (наследственные тела). У людей это всегда происходит парами в клетках тела, одна из которых наследуется от матери, а другая - от отца. В этом смысле все клетки тела человека содержат в общей сложности 46 хромосом - 22 пары так называемых аутосом и одну пару так называемых половых хромосом

С помощью лабораторного процесса ПЦР, с одной стороны, можно исследовать тонкую структуру ДНК человека, что важно для диагностики заболеваний или для уточнения конкретных вопросов:

• Выяснение наследственных заболеваний,
• Оценка риска заболевания,
• Исследование врожденных особенностей обмена веществ,
• судебно-медицинский (так называемый «судебно-медицинский») анализ (например, доказательство отцовства) и многое другое

С другой стороны, не только люди имеют соответствующий генетический состав, но фактически все формы жизни на Земле имеют специфический генетический состав:

• Животные,
• Растения,
• Грибы,
• Бактерии,
• Вирусы,
• Паразиты и др.

Генетический состав этих форм жизни также состоит в основном из ДНК или, в случае некоторых вирусов, также из РНК (рибонуклеиновой кислоты), которая, в отличие от ДНК, является одноцепочечной. Поэтому в медицинской диагностике ПЦР также используется для выяснения многих инфекционных заболеваний:

• бактериальные инфекции (например, туберкулез, бактериальные заболевания, передающиеся половым путем),
• вирусные инфекции (например, вирусный гепатит, ВИЧ-инфекция),
• паразитарные инфекции (например, малярия) и многое другое

Как работает ПЦР?

Метод ПЦР был разработан в 1983 году американским биохимиком Кэри Б. Маллис и в основном основан на двух принципах:

• Умножение («амплификация») небольшой части генетического материала (ДНК или РНК).
• Обнаружение и идентификация умноженных («амплифицированных») продуктов амплификации.

Следовательно, для проведения ПЦР требуются следующие компоненты:

• тестовый материал (например, кровь, образцы клеток или тканей),
• определенные реагенты («полимераза», «праймер», «нуклеотиды» [это строительные блоки ДНК] и т. д.), а также лабораторное оборудование для амплификации генетического материала.
• система обнаружения продуктов ПЦР.

Что касается реагентов и лабораторного оборудования, необходимых для проведения ПЦР, в основе всего процесса ПЦР лежит следующий фермент:

полимераза Taq

Это фермент, полученный из микроорганизма Thermus aquarius (Taq) - штамма бактерий, который существует вблизи горячих вулканических источников и может выжить, адаптировавшись к высоким температурам окружающей среды.

Особенность полимеразы Taq заключается в том, что этот фермент также может выполнять свою функцию при высоких температурах выше 50 ° по Цельсию (C), а именно:

умножение («амплификация») ДНК

Помимо полимеразы Taq, перед анализом ПЦР необходимо точно определить, какая часть ДНК должна быть исследована. Для этого вам понадобятся короткие фрагменты ДНК, тонкая структура которых соответствует целевой области ДНК с учетом соответствующего генетического кода («последовательность ДНК»). Эти фрагменты ДНК называются

«Грунтовка» называется

Фактический процесс амплификации в контексте ПЦР, наконец, включает следующие этапы:

• Извлечение генетического материала (ДНК или РНК) из тестового материала.

  При исследовании РНК кодовая последовательность рибонуклеиновой кислоты должна сначала быть преобразована в кодовую последовательность ДНК, что должно быть выполнено с помощью фермента «обратная транскриптаза» на аналитическом этапе перед фактической амплификацией

• Амплификация генетического материала в несколько этапов («циклов»):

  • Шаг первый - «денатурация ДНК»: при нагревании (95 ° C) двухцепочечной ДНК она плавится в одноцепочечные.
  • Шаг второй - «Отжиг»: при более низкой температуре (примерно 55 ° C) «праймеры» теперь могут прикрепляться к своим целевым последовательностям ДНК.
  • Шаг третий - «удлинение»: при температуре 72 ° C фермент Taq-полимераза теперь удлиняет («удлиняет») стартовую последовательность праймера с помощью так называемых «нуклеотидов» (это строительные блоки ДНК) и наращивает ее. таким образом появляется новая удлиненная молекула ДНК.

Поскольку шаги с первого по два повторяются в несколько циклов, создаются все более длинные и длинные вновь образованные цепи ДНК, отсюда и название этого лабораторного процесса «полимеразная цепная реакция».

• Анализ вновь созданных цепочек ДНК (так называемые «продукты ПЦР»):

  В конце цепной реакции (циклов) продукты ПЦР - т.е. вновь созданные молекулы ДНК - исследуются и оцениваются качественно или количественно. Существует множество возможностей для самой этой оценки, в основном основанных на окрашивании (особенно флуоресцентными красителями) ДНК и ее визуализации (с помощью гель-электрофореза или фотометрической флуоресценции)

Какие результаты дает ПЦР?

Результаты современных методов ПЦР можно разделить на две группы:

• качественный и
• количественные результаты.

В качественной ПЦР проверяется, присутствует ли определенный сегмент генетического материала (ДНК или РНК) в тестовом материале («положительный» результат) или нет («отрицательный» результат).

Поэтому качественная ПЦР в основном используется для уточнения следующих диагностических вопросов (результаты «да / нет»):

• Диагностика наследственных заболеваний,
• Уточнение мутаций,
• Распознавание генетических характеристик (например, предрасположенности к определенным заболеваниям) и т. Д.

Количественная ПЦР - это дальнейшее развитие этого лабораторного метода, с помощью которого выявляется не только наличие определенной области генетического материала, но и количество генетического материала. Соответственно, количественная ПЦР в основном используется в следующих областях медицины:

• В рамках диагностики инфекции можно точно определить количество болезнетворных микроорганизмов в организме пациента. В случае вирусных инфекций этот метод ПЦР используется для лечения так называемых

  Исследована вирусная нагрузка

Кроме того, количественная ПЦР также очень важна в фундаментальных исследованиях, при этом не только медицина человека, но и ряд других научных областей (ветеринария, биохимия, биология и т. Д.) Выигрывают от этого процесса.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний заключается в том, что результаты тестирования этого лабораторного метода доступны чрезвычайно быстро (обычно в течение одного рабочего дня). Кроме того, ПЦР - высокочувствительный лабораторный метод. Это означает, что даже минимальное количество бактерий или вирусов в исследуемом материале приводит к надежно положительному результату.

Есть ли дальнейшие разработки в области традиционной ПЦР?

Специальным дальнейшим развитием методологии ПЦР является

Мультиплексная ПЦР

В мультиплексной ПЦР одновременно используются несколько целевых последовательностей ДНК (читай: несколько праймеров). Это создает смесь продуктов ПЦР, которые необходимо детектировать и оценивать соответствующим образом.

Мультиплексная ПЦР также в основном используется в медицине.

• человеческая генетика
• диагноз инфекции.

Преимущество этого метода заключается в том, что в целом от пациентов нужно получать меньше тестового материала, и за один этап анализа можно получить серию результатов тестов. Однако эти преимущества в отношении диагностики во многих случаях нивелируются высокой стоимостью анализа.

Еще одна особенность использования ПЦР - лабораторный процесс

Секвенирование ДНК

Это диагностическая возможность расшифровать точную последовательность генетического кода пациента. Метод секвенирования также может быть основан на технологии ПЦР.

Однако, поскольку секвенирование является значительно более сложным и дорогостоящим, чем обычные методы ПЦР, в настоящее время оно предназначено для специальных диагностических (расширенный анализ генома) и научных вопросов.

Каковы основные области применения ПЦР?

Что касается областей применения ПЦР в медицине человека, эта лабораторная процедура используется для решения следующих диагностических вопросов:

• Выяснение наследственных заболеваний - уже существуют методы ПЦР более 600 различных наследственных заболеваний.
• Фармакогенетика - изучая генетические особенности метаболизма печени, можно сделать выводы об эффективности и дозировке лекарств.
• Онкологическая медицина («онкология») - здесь, с одной стороны, ПЦР используется для выяснения факторов риска некоторых опухолевых заболеваний (например, рака груди). С другой стороны, клетки и ткани в уже возникших опухолях также могут быть исследованы на предмет различных мутаций, что, в частности, играет все более важную роль в лечении этих заболеваний.
• Судебная медицина («криминалистика») - здесь ПЦР имеет большое значение, например, при установлении отцовства и в криминологии («снятие отпечатков ДНК»).
• Инфекционная медицина - ПЦР имеет незаменимое значение в диагностике, прогрессировании и контроле терапии бактериальных, вирусных и паразитарных инфекционных заболеваний.

Для получения дополнительной информации о раке см. Рак.

Существуют ли контрольные значения для результатов ПЦР-теста?

Что касается эталонных значений в методах ПЦР, всегда следует учитывать соответствующий диагностический вопрос. Поскольку определенные генетические особенности выявляются в рамках исследования наследственных заболеваний (например, анализа мутаций), в таких лабораторных анализах нет эталонного значения («положительного» или «отрицательного»), как, например, нет эталонного значения для цвета волос. Потому что цвет волос - это тоже генетическая характеристика.

Кроме того, лабораторные анализы на врожденные наследственные признаки подлежат строгим правилам в этой стране, для которых имеют силу положения Австрийского закона о генной инженерии (GTG) (определение существующего заболевания в соответствии с разделом 65 GTG). В результате этот анализ может быть проведен медицинской лабораторией только после получения письменного подтверждения от лица, подлежащего обследованию, законного опекуна (в случае несовершеннолетних, неспособных принять решение) или законного представителя (в случае лиц в возрасте, которые неспособны принимать решения) о всеобъемлющей информации, предоставленной В отношении этого генетического теста должен быть проведен лечащий врач (Раздел 69 GTG).

Кроме того, пациенты обычно имеют право запретить проведение генетических тестов на себе.

Однако для лабораторных анализов генетической ПЦР, не относящихся к человеку, применяются гораздо менее строгие правила. В основном это касается лабораторных методов из области диагностики инфекций.

Что касается эталонных значений этих лабораторных методов, следует проводить различие между качественными и количественными методами:

Качественные методы ПЦР обычно дают «положительный» или «отрицательный» результат, при этом «отрицательный» обычно является эталонным значением

С помощью метода количественной ПЦР, в зависимости от метода, определяются соответствующие пороговые значения (так называемые «пороговые значения») с момента, когда результат должен быть оценен как патологический.